大鼠膝关节周围微小动脉网分布及计数法的评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.09.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (9): 1319-1324.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.09.002

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大鼠膝关节周围微小动脉网分布及计数法的评价

王簕，娄爱菊，丁强，杨波，陈涛，唐龙，章波，尹飚，宋庭，张志

广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150

出版日期:2014-02-26 发布日期:2014-02-26
通讯作者: 张志，硕士，主任医师，广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150
作者简介:王簕，男，1982年生，湖南省湘乡市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨组织工程研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金(31200726)；广东省自然科学基金(s2013010011532)；广州市科技计划项目(2013J4100101)

Evaluation methods for small vascular network distribution and counting around the knee joint in rats

Wang Le, Lou Ai-ju, Ding Qiang, Yang Bo, Chen Tao, Tang Long, Zhang Bo, Yin Biao, Song Ting, Zhang Zhi

Institute of Orthopedics and Traumatology, the Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Online:2014-02-26 Published:2014-02-26
Contact: Zhang Zhi, Master, Chief physician, Institute of Orthopedics and Traumatology, the Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Wang Le, Master, Attending physician, Institute of Orthopedics and Traumatology, the Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31200726; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. s2013010011532; the Science and Technology Plan of Guangzhou City, No. 2013J4100101

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着骨组织工程研究的不断深入和对骨代谢过程的不断认识，分析组织工程骨的血液供应和营养状况已成为目前的研究重点。
目的：比较和评价常用的微小血管检测方法，明确各种方法的利弊，为研究组织工程骨内微血管的分布和计数提供借鉴意义。
方法：分别用3种常用的血管评价法对SD大鼠膝关节周围微小动脉网进行分析对比，18只SD大鼠均分为免疫组化组、血管造影组、CT扫描重建组。
结果与结论：免疫组化技术能观察到血管的分布范围，但是无法评价血管空间分布的整体情况。血管造影技术和CT检查则可以提供形象的血管空间分布图，但是CT检测时部分微小血管显示不清。免疫组化检出(26.50±3.02)条血管数明显多于血管造影(14.12±1.47)条和CT检测(9.00±1.79)条，其中CT检测组可检出的血管数最少。说明免疫组化和血管造影可以为微小血管提供微观和宏观的评价方法，从两个层面一起观察，更好的分析血管的情况，对微血管的评价有很好的借鉴意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

全文链接：

关键词: 植入物, 关节植入物, 大鼠, 膝关节, 微小动脉, 血管网, 微血管, 血管造影, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With the deepening of bone tissue engineering research and bone metabolism understanding, it is a hotspot to analyze the blood supply and nutritional status of tissue-engineered bone.
OBJECTIVE: To compare different methods for evaluating small vascular network distribution around the knee joint in rats in order to provide a guideline for the study of microvascular network in tissue-engineered bone.
METHODS: Eighteen Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups, with six rats in each group. Three commonly methods were used to evaluate the small vascular network around the knee joint in rats: immunohistochemistry analysis, angiography analysis, and CT scans and reconstruction analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The microstructure of vascular network could be observed by immunohistochemistry, but the spatial distribution of vessels could not be evaluated. The spatial distribution of vessels could be showed by angiography and CT scans. However, some of micro vessels were showed unclearly by CT scans. The number of blood vessels detected by immunohistochemistry was (26.50±3.02) vessels, significantly higher than those detected by angiography and CT scans that were (14.12±1.47) and (9.00±1.79) vessels, respectively. Combination of immunohistochemistry and angiography can evaluate the microvascular network at microscopic and macroscopic levels, which can provide the whole information of the vascular network.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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Key words: knee joint, arterioles, microvessels, angiography

中图分类号:

R318

王簕，娄爱菊，丁强，杨波，陈涛，唐龙，章波，尹飚，宋庭，张志. 大鼠膝关节周围微小动脉网分布及计数法的评价[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(9): 1319-1324.

Wang Le, Lou Ai-ju, Ding Qiang, Yang Bo, Chen Tao, Tang Long, Zhang Bo, Yin Biao, Song Ting, Zhang Zhi. Evaluation methods for small vascular network distribution and counting around the knee joint in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(9): 1319-1324.

图/表（结果） 2

2.1 SD大鼠膝关节周围微小动脉网的分布情况 免疫组化染色后可见膝关节周围有较丰富的微小血管分布，主要营养周围肌肉组织，小动脉形态清晰(图1A)，部分微动脉与微静脉的辨认较困难。

血管造影摄片后可以显示SD大鼠膝关节周围血管网的分布整体情况，可见膝关节周围血管网主要起于股动脉，在膝关节上方约股骨髁水平的内后方分为数支小动脉，营养膝关节周围的肌肉组织(图1B)，并有一二支细小分支进入股骨远端或胫骨平台，营养该处骨组织，但该分支在不同大鼠间存在变异。在摄片组中，显影检测出该分支的大鼠有3只，占50%。膝关节周围血管网中最大的一支血管在小腿后方的肌肉组织中延续下行，移行为胫后动脉，主要营养下肢的肌肉和骨组织。

2.2 SD大鼠膝关节周围微血管计数在免疫组化检测组中，膝关节横断面切片中可见褐色深染的部位，考虑为微血管所在的位置(图1A)，在×400镜下可见管状样微血管结构，根据软件计算，膝关节周围微血管网分支为(26.50±3.02)条，其中血管直径为(300.00±119.83) μm，血管形态不一，软件计算时对于微动脉与微静脉的辨认则比较困难。

在血管造影摄片组中，膝关节周围可见数支微血管显影，其中长度超过1mm并可计数的血管数为(14.12± 1.47)条，计数的血管直径平均为(608.33±274.62) μm (图1B)。微血管网自股动脉分出后成爪牙状分布于膝关节周围软组织中，有一两支细小分支营养股骨远端和胫骨平台，最大分支向远端续于胫后动脉。

在CT扫描重建组中，在膝关节后方可见膝部的动脉发出数支细小分支，环绕膝关节周围，并营养周围肌肉组织和骨组织，可计数的微血管数为(9.00±1.79)条，平均直径为(905.00±174.56) μm，部分微血管显影不完整或不清晰，计数相对困难(图1C)。

各组间微血管数的比较见表1，其中免疫组化组可计数的血管数多于血管造影组，而血管造影组中可计数的血管数则多于CT扫描重建组，并且3组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。同时，免疫组化组检出的血管管径最小，CT组检出的血管管径最大，各组间比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：于2013年5至9月在广州医科大学附属第三医院骨科实验室完成该工作。

材料：

实验动物：健康Sprague-Dawley(SD)大鼠18只，雌雄不限，体质量220-260 g，由广州医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

主要试剂及仪器：岛津数字放射成像系统摄片机和东芝TSX-101A 64排螺旋CT(广州医科大学附属第三医院放射科)，Mimics三维重建软件(10.01版；Materialise)。免疫组化所用CD31抗体、二抗，SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。

实验方法：

实验设计：18只SD大鼠用随机数字表法均分为3组(n=6)。对膝关节周围即股骨髁处至胫骨平台间的微小动脉网进行观测和计数，免疫组化组：用CD31标记组织内血管内皮细胞；血管造影组：通过注射对比剂，摄片观察微小动脉的分布情况；CT扫描重建组：通过CT扫描成像，借助Mimics软件重建，观察微小血管情况。

免疫组化组的血管计数由两位经验丰富的病理科医师完成，血管造影组和CT扫描重建组由2位经验丰富的影像科医师完成。

免疫组化检测：完整截取SD大鼠右侧膝关节区组织，取材范围近端起自股骨中下1/3，远端止于胫骨平台下方，骨组织周围软组织保留，用体积分数10%甲醛固定，EDTA脱钙液脱钙，石蜡包埋后行 5 μm厚横行切片。将脱钙后的组织切片按SABC试剂盒说明书行免疫组织化学染色检测CD31。用已知CD31表达的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗液作阴性对照。200倍光镜下观察CD31阳性表达部位。每张切片随机选4个×400倍视野用图像分析软件(Image Pro-Plus 6.0，美国)测定阳性物质的积分吸光度值(A值)。按作者前期评价方法对膝关节区软组织内血管进行计数^[13-14]。

SD大鼠股动脉穿刺：10%水合氯醛溶液(0.4 µL/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，固定四肢和头部，于左侧腹股沟区备皮、消毒和铺巾，沿股动脉行径，作一长约1.5 cm皮肤切口，依次切开皮肤、皮下组织和深筋膜，在腹股沟区仔细分离并显露股动脉、股静脉和股神经，尽量避免不必要的损伤，结扎股动脉远心端，近心端用微创动脉夹夹闭，在结扎处和动脉夹处股动脉下方分别穿两根5-0的丝线备用。用24号BD静脉留置针穿刺股动脉，然后固定针芯，小心送入静脉留置针，用预先备用的丝线固定，静脉留置针用肝素盐水抗凝排气，备用。对比剂选用泛影葡胺，以 20 mL/min向股动脉内持续注入。

血管造影检查：左侧股动脉穿刺置管后，将SD大鼠仰卧于检查平台上并固定四肢，按照上述方法向SD大鼠左侧股动脉持续注入对比剂，自对比剂注入开始，连续摄片20-30 s，摄片时观察右下肢膝关节周围血管分布情况。摄片条件：75 kV，50 mA。根据所观察血管的情况，调节合适的窗宽、窗位，最终图像上传至PACS系统软件。选取膝关节周围区域，计算该区域中显影且血管长度至少为 1.0 mm的血管数目。

CT扫描重建检查：同血管造影检查法，将SD大鼠固定，用64排螺旋CT对右下肢膝关节周围区域进行扫描成像，扫描参数：120 kV，150 mA，螺旋容积扫描，重建层厚0.5 mm，将扫描获得图片上传至PACS系统。将图片按Dicom格式储存，导入Mimics软件，通过区分密度值，利用三维计算功能，重建膝关节周围微小动脉网，借助图像三维旋转功能，对该区域中显影且血管长度至少为1.0 mm的血管进行计数。

主要观察指标：主要观察大鼠膝关节周围微小血管网的分布情况，比较不同技术对微小血管显影的效果。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，各组间微小动脉的均数比较采用单因素方差分析，若有显著性差异则用SNK法进行多重比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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讨论

随着对骨代谢认识的不断深入，研究发现正常骨组织的存活有赖于血管进行营养供应，因此血管在骨骼的发生与修复过程中所起的作用不言而喻^[15-16] 。同时，骨组织工程技术不断发展，提出了血管化组织工程骨的构建要求，这不但要求构建带有血管支配的组织工程骨，而且还需要对组织工程骨的血液供应情况进行检测^[17-18] 。但是由于营养正常骨组织和组织工程骨的血管管径细小，检测比较困难。另外，由于骨组织工程构建技术目前主要停留在实验动物阶段，检测组织工程骨的血液供应则往往需要借助实验动物模型，其中SD大鼠是目前常用的实验动物^[19-20] ，但是SD大鼠的血管管径也非常细小，更不利于检测，这些因素都直接影响了实验结果的评价，为此实验对比了目前几种常用的微小血管评价方法，希望能为微小血管的评价提供借鉴意义，利于实验的深入开展。
为了客观评价SD大鼠膝关节周围微小动脉的分布情况并进行血管计数，首先要明确血管的类型^[21-22] 。一般情况下，动脉分为大动脉、中动脉、小动脉和微动脉4种，其中小动脉属于肌性动脉，其管径一般在0.3-1.0 mm，微动脉主要参与毛细血管网的构建，其管径在0.3 mm以下。在常用的大鼠下肢节段性骨缺损模型中，选用的组织工程骨的长度一般在0.7-1.0 cm，而前期研究发现[23]，营养组织工程骨的动脉则主要是小动脉和微动脉^[24-25] ，因此，实验中关注和检测的动脉也集中于这两种动脉。另外本研究发现，SD大鼠膝关节周围的动脉网直径一般在250-900 μm，正好属于小动脉和微动脉范畴^[26-28] ，所以实验选择计数SD大鼠膝关节周围血管网来对评价这微小动脉的检测方法。
在免疫组化检查时，通过组织学染色可以弥补血管造影的不足，检出管径更为细小的微血管走形，对于血管形态的评价和分析则主要集中于微观水平，但是无法直观的评价血管与骨组织间的关系^[29-30] 。另外，作者研究发现，免疫组化检查对于微动脉与微静脉的辨认相对比较困难，可能是由于血管内皮细胞均能被CD31染色所致，同时计算机软件对血管的计数主要是根据IOD值计算的，无法区分血管形态，这些因素都可能造成血管计数的偏差。
当选择血管造影进行检测时，可以清晰的显示膝关节周围微小动脉的走形和分布位置，正如实验结果中所述，SD大鼠在膝关节水平有丰富的动脉网营养周围组织，其供应范围包括膝关节的骨组织和肌肉组织，但是图片仅限于二维图像，不能全方位观察血管分布，Lewis也发现同样问题，但是该技术在显示血管形态和走行方面优势明显^[31-32] 。另外，借助造影技术，显示的血管主要是小动脉，对于微动脉的显示则比较困难，而且微动脉显影不清晰。实验结果中发现，在造影组中，膝关节骨组织的营养动脉在个别大鼠中可以检出，这是由于其他大鼠的血管管径太小无法辨认还是由于解剖变异造成，目前仍不明确^[33-34]。
范猛等^[35]在保留骨矿物成分及骨结构的前提下，应用亚纳米级硫酸钡作为血管对比剂，通过Micro-CT对骨内微血管结构进行二维及三维显像，并实现血管、骨显微结构及骨矿物量的同步定量评价，血管造影不干扰组织学检查，能清晰显示骨内微血管，作者认为以亚纳米级硫酸钡作为对比剂，基于Micro-CT的骨内微血管造影能够直接反应骨内血管，并能将骨结构同时显示并进行定量评价且不破坏标本，为骨坏死、骨折、骨肿瘤的研究提供了新方法。
CT扫描重建技术在血管形态学研究方面本应该具有更明显的优势，因为通过三维重建技术，可以还原血管的形态，而且还可以提供动态可视的三维图像^[36-37] 。王健明等^[38]回顾性分析61例亲属活体肾移植供者移植前64层螺旋CT血管成像及三维重建影像资料，观察供肾实质、肾动脉、肾静脉和肾盂、输尿管排泄系统，64层螺旋CT血管成像及三维重建图像基本清晰显示所有供者的双肾解剖结构及毗邻关系情况。肾实质密度及肾动脉管径、形态均正常，其中47例双肾均为单支肾动脉，4例左肾为2支肾动脉,5例右肾为2支肾动脉，5例双肾均为2支肾动脉，53例容积再现结合最大密度投影图像对输尿管排泄系统显示较好，49例表面遮盖成像图像较好地显示了肾动脉主干的起源、管径、形态及与周围组织的解剖关系，肾动脉CT仿真内镜成像能清晰显示腹主动脉、双肾动脉开口及肾动脉管腔，61例供者均行单侧肾切除，术前血管成像结果与术中所见基本吻合。说明64层螺旋CT血管成像及三维重建后处理技术能真实反映肾血管的解剖及毗邻关系，,在某种程度上完全可以替代数字减影血管造影，可作为术前评估活体供肾血管的有效方法。
李雪萍等^[39]通过16层螺旋CT肺血管造影及三维重建技术诊断肺癌血供，采用平扫+增强+16层螺旋CT肺血管造影及三维重建技术结合的方式进行检查，结果螺旋CT重建组诊断率明显高于对照组，且肿瘤血供清晰度明显。可见16层螺旋CT肺血管造影联合三维重建技术能提高肺癌诊断率，并能很好地反应肿瘤的血供情况。李国策等^[40]根据原始图像、容积重现像和最大密度投影像,对3种方案肺动脉分支的显示情况、肺动脉边缘清晰程度及肺静脉充盈程度进行评分,并测量肺动脉内对比剂的浓度，结果提示低剂量对比剂在多层螺旋CT犬肺动脉成像中是可行的，图像质量可以满足临床诊断要求，从而为临床应用低剂量对比剂行肺动脉成像提供实验依据。但是在实验过程中，应用CT扫描重建技术后，显示的血管形态反而不如血管造影技术清晰和完整，个别血管出现显影不全、中断、不显影，同时可观察到的小动脉数目也没有血管造影和免疫组化多，因此提示CT三维重建技术虽然能提供全方位的血管观察效果，但是仍不能满足小动脉和微动脉检查。
另外，实验在比较3种血管显影时可以发现，免疫组化法检出的血管管径最小，CT扫描检出的血管管径则较粗，这可能是由于血管造影和CT扫描成像时会出现伪影所致^[41-45] ，特别是CT扫描图像重建后，伪影更加明显。也有可能是血管注入对比剂过程中，由于压力增加，迫使血管扩张导致，因此在利用血管造影或CT成像结果解释血管管径时应慎重^[46-50] 。
就本实验目前所比较的几种微小血管评价方法而言，借助免疫组化技术和血管造影技术，可以为小动脉和微动脉提供微观和宏观的评价方法，从两个层面一起观察，可以很好的分析血管的情况。CT三维重建技术虽然扫描层厚能达到0.5 mm，但是仍不能满足微小血管的检测要求，目前为了克服CT技术的不足，发挥CT可提供三维图像的优势，出现了一种新的检测仪器，既micro-CT^[51-53] 。micro-CT可用于实验动物微小血管的显影和检测，并且可以显示骨小梁的结构，在组织工程骨的血管检测中具有无可比拟的优势^[54-55] ，但是该检测仪器目前价格高昂，仍未得到普及应用。因此，实验结果提示，对于微小血管的检测和分析，可采用血管造影技术和免疫组化技术相结合的方法，从而可以更全面的评价微小血管的分布情况并进行血管计数。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
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大鼠膝关节周围微小动脉网分布及计数法的评价

Evaluation methods for small vascular network distribution and counting around the knee joint in rats

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